采用全整合式连续抗体生产工艺对产量和产物成本的影响
来自美国MedImmune公司的研究人员在2019年第14期的《Biotechnology Journal》杂志上发表了题为“Implementation of Fully Integrated Continuous Antibody Processing Effectson Productivity and COGm”的文章。文中，研究人员成功证实了从中试规模生物反应器到药物底物获得的全整合式连续工艺。该工艺可获得与500L补料分批传统工艺相当的产物质量。连续工艺生产物料的速率是每4天获得1kg纯化的mAb，相比补料分批，产量提高了4.6倍。使用BioSolve软件进行的工厂吞吐量分析显示，一个传统上使用4 x 12,500L不锈钢生物反应器以及相应规模纯化链的补料分批工厂，可以替换为由 5 x 2,000L一次性使用生物反应器以及占地更小的纯化链组成的连续设施，成本可降低15%。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
随着全球生物制药市场格局变得日益复杂以及生物仿制药开始进入市场，目前行业面临的一个主要挑战是开发更加经济高效且灵活的生产工艺。在其它很多行业，连续工艺已经替代了批次生产，因其可提高效率、灵活性以及产量，现在，生物制药行业也在积极地开发连续生产技术，以期实现这些目标。连续细胞培养工艺已经被使用了很多年，主要用于生产不稳定的蛋白质，例如酶或凝血因子，这些产品需要连续的收获，以获得最佳的产品质量。基于灌流的连续工艺的成熟以及近期连续蛋白质纯化技术的发展，使得开发全整合式连续生产成为可能。对此类工艺获得更高单位体积产量的优势，行业内已达成共识，而此前对COGm（产品生成成本）的经济性分析结果却不尽相同。但不管怎样，技术的进步为在构建新的生产工厂时，提高生产灵活性、降低资本投入以及公共设施成本提供了机会。本文证实，连续工艺增加的产率可降低设备尺寸，这可允许使用一次性使用技术。此外，由于消除了单元操作之间的储罐，可进一步降低工厂占地。连续工艺也可降低与工艺失败相关的成本。在批次方案中，任意一步的失败都有可能导致药物底物完全损失。在连续工艺中，特别是在上游单元中，如果发生一个工艺偏差，偏差发生前的所有物料将可被传送至MCC（多柱层析），如果偏差后工艺恢复，之后的物料可以传输交付。如果在纯化链中发生工艺偏差，失败点上游的所有物料可转移到临时的储罐，并对偏差进行纠正。在两种情况中，连续工艺均可在工艺恢复后继续进行。所以，连续工艺的优势不仅在于经济性和吞吐量分析中的那些参数。
在对连续工艺的不断追求中，很多公司，如Genzyme、Bayer、Janssen、Merck、Novartis和Lonza，都在连续工艺开发中投入了大量的精力，而有些公司已经在其生物药生产中整合了连续工艺元素。
本文介绍一种用于IgG的全整合式连续生产，其包括生产生物反应器到制剂单元操作，将现有技术和新兴技术相结合，如将前期工作已经优化的灌流工艺及连续收获成功地与新开发的中试规模连续纯化工艺相整合。研究采用一次性使用技术，如ATF、生物反应器、过滤器和膜，以模拟将来的一次性使用工厂。研究讨论稳态细胞培养方法以及连续纯化和制剂中使用的技术及其工艺性能。COGm分析用于比较假定的以不同工艺持续时间运行的批次和连续方案的成本分解。模型显示，相比在12,500L规模下进行的批次工艺，使用2,000L连续工艺，进行30天的运行，可使COGm降低15%。
材料和方法
细胞系和接种液扩增
实验使用一种产IgG1 嵌合融合蛋白的CHO源性细胞系。冻存细胞在专利的无动物蛋白培养基中复苏，摇瓶分瓶，体积从50mL增加到2L，直到获得足够接种最终种子罐的体积。2L摇瓶用于接种2L规模生产生物反应器（Applikon）或15L种子生物反应器（Bellco）用于接种50L规模生产生物反应器（ThermoFisher）。
在灌流生物反应器中生产
最终种子罐中达到预定的活细胞密度（VCD）标准后，细胞接种至2L玻璃罐或50L一次性使用生物反应器，进入生产阶段。接种后2天，以1.5 VVD的速率开始灌流，使用专利的无动物蛋白灌流培养基。2L和50L规模灌流运行分别使用XCell ATF 2和一次性使用XCell ATF 6设备，配用合适尺寸的0.2μm 聚醚砜中空纤维过滤器（Repligen）。设置交替式切向流速，以保证最低的单位体积切向流速与单位体积滤液流速比例为150:1。当VCD达到＞80x10^6 cells/mL时，开始细胞废弃，以将VCD维持在80-120x10^6 cells/mL之间。此时，开始收集滤液，并进行后续处理。细胞废弃的速率根据计算的生长速率和当前的废弃速率进行计算，并每天调节，以在每个取样点后24小时内，达到计划的VCD 100x10^6 cells/mL[公式1]。生物反应器的所有其它设定点通过在配有XCell ATF 2的2L 生物反应器上的一系列优化试验预先确定。使用ViCell进行每日细胞计数。使用RAPIDPoint 500 血气系统进行每日气体和代谢物检测。
公式1
在之前的实验中已经证实了相同细胞系使用该策略的稳态细胞密度范围以及长达90天的产率，该数据用于到50L的工艺规模放大。
药物中间体样品蛋白质浓度使用SoloVPE（C Technologies）在280nm下进行检测。
工艺链完整操作以及分析，请参考原文。
用于药物底物生产的A）补料分批工艺以及B）实验性执行的完整合式连续工艺示意图。黑色箭头表示工艺中使用0.2μm过滤器的位置（L.Arnold, et al. 2019）。
讨论
整体来看，该概念验证研究证实，全整合式连续工艺在降低用于工厂构建的资本投入以及生产成本方面，相当有吸引力，且可达到与补料分批相当的产物纯度。通过将批次生产转换成连续生产，整体COGm可降低15%。
补料分批和连续工艺性能数据的比较，包括A）活细胞密度（VCD）和活性，B）归一化的单位体积产量，C）多柱层析单元操作中5根层析柱每根的洗脱峰，D）整个运行时长中，连续病毒灭活步骤低pH和中和产物的pH趋势，箭头指示中和后轻微的pH偏移点，以及D）制剂前原液中的聚体、宿主细胞蛋白以及DNA。补料分批VCD和活性图表示不同规模的平均值。两种不同规模连续工艺的平均单位体积产量按平均补料分批数据进行标准化处理。JMP13单向方差分析显示p<0.01（L.Arnold, et al. 2019）。
批次和连续生产方案中的产物成本分析。批次方案代表12,500L生产生物反应器以及可处理所有生物反应器的合适尺寸纯化链。连续工艺代表不同持续时间的2,000L生产生物反应器，并由合适尺寸的单个下游工艺链纯化。每个类别的COGm百分比按批次方案进行归一化处理。（L.Arnold, et al. 2019）。
采用连续生产，并向一次性使用技术转变，可促进更快的设施构建以及更加灵活的工厂设计。CIP系统的消除可降低与CIP操作、维护以及安装相关的失败点。也有概念提出未来的设施设计将置于开放的宴会厅式布局中，而不是将单元操作的每一套设备置于分开的房间中。该设计不仅可以降低构建的时间，也可以增加生产吞吐量的灵活性，并且可简单将设备用于多产品生产的情况，同时资本投入更低。结果是除单位体积产量提升外，进一步的COGm降低。开放的宴会厅设计概念可消除在专用的产品设施中常见的设施适配性限制，如缓冲液罐限制或生物反应器产能不足。它还可以快速地增加额外的设备，而不需要较长的停机时间。
除了以上定量优势外，连续工艺还可以带来其它优势，简化从临床向商品化生产的过渡。在批次工艺中，商品化生产运行需要比临床I期运行更大的罐。在连续工艺中，从临床I期到商品化生产的需求的增加可通过延长运行时间来满足（即以时间为单位进行规模扩展）。设备适配性以及可放大性评估和规模缩小模型的开发工作可显著降低，因为消除了临床I期生产之后的规模放大需求。
相比批次工艺，连续工艺的开发和优化需要关注不同的方面。除了提高单位体积产量，上游工艺开发可能需要更加关注通过降低灌流速率以降低培养基使用。更低的灌流速率的另一个优势是可更容易地放大至更大体积的罐，以缓解可用的过滤器膜面积及相应的可达到通量值的限制。另一个重要的点是需要了解在高细胞密度灌流环境中，克隆的特性是否能保持良好，尽管对此目前还没有太多可用的信息，但是评估现有批次培养中的高通量克隆筛选方法是否适用于连续灌流培养还是值得的。下游工艺开发在很大程度上将保持不变，工艺参数仍可使用小规模批次实验进行确定。相比批次，连续工艺转换至生产规模对尺寸方面的调整要求更低，但还是需要一定过渡性的研究，以实现连续。从长远来看，克服这些过渡性风险，将在提高产量、优化COGm以及其它与连续工艺相关的优势上获得回报。连续工艺延长的下游运行时间需要纯化工艺维持生物负荷以及内毒素控制。伽马辐照的可抛弃型系统结合溶液消毒程序将是必需的。微生物生长的任意迹象的快速鉴定以及快速在线微生物和内毒素检测系统可通过系统的重新消毒和/或更换可抛弃型部件，而助于实现连续的下游生产。
如文章所示，连续工艺可为生物制药行业提供诸多降低生产成本、提高吞吐量的机会。连续工艺需要将关注点转移到工艺开发上来，此外，还需要对一些操作要求进行调整。但是，随着新的连续工艺技术的持续发展，所有这些未来的挑战都有可能被克服，连续工艺在不远的将来，可能成为普遍的做法。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：L.Arnold, K.Lee, J.Rucker-Pezzini, Implementation of Fully Integrated Continuous Antibody Processing Effects on Productivity and COGm. Biotechnology Journal, 2019, https://doi.org/10.1002/biot.201800061.
XCell ATF 工作原理
XCell ATF 简介
使用斜率光谱法进行快速、可重复且更准确的蛋白质浓度检测
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