什么是微型高通量纯化？为什么它是生物工艺的未来？
什么是微型纯化？
“微型纯化”是指使用填料板、微型层析柱或吸液器吸头，在微型规模上，进行目标产物的纯化。这种技术对样品和填料体积的需求更低，从而减少了资源需求，并可实现实验的平行性处理。
当使用增强的方法，如实验设计(DoE)，来优化纯化条件时，平行化尤其有益。其可以在单次运行中研究更多的参数，以允许迭代优化以及缩短工艺开发的时间。
微型纯化是高通量工艺开发(HTPD)的一部分，其依赖于自动化液体处理器的使用。自动化微型纯化的主要好处包括：
高通量 - 液体处理机器人可以平行执行多个运行，并连续操作数个小时，而不会感到“疲劳”
可重复性 - 同一方案可以反复执行
可追溯性 - 机器人执行的所有实验步骤都会被记录并保存起来，以供后续参考
精确性和准确性 - 不同的机器人能够以相同的精确性和准确性执行相同的实验，消除人为误差和操作者之间的差异
什么是微型层析柱，它们的应用是什么?
微型层析柱可装填50-600 µL填料，是常规柱层析的规模缩小模型，这个规模缩小模型可以可靠地放大到更大的柱体积。
Repligen（原Atoll）最先开发了微型层析柱，即名为OPUS® RoboColumn®的预装层析柱，并与实验室自动化设备领先供应商Tecan一起开发了自动化纯化。合作促成了Te-Chrom®模块的开发，该模块支持在配备有固定钢针的Tecan Freedom EVO®和Tecan Fluent® 液体处理工作站上使用微型层析柱。此外，RoboColumn®也支持用于PerkinElmer JANUS G3 BioTX™ Pro 等机器人液体处理工作站。
在过去的十年中，微型层析柱已被常规性用于抗体和其它蛋白质产品的纯化。而最近，制药工艺研发团队已经开始展示病毒类产品高通量纯化的成功案例。例如，伦敦大学学院的一个团队采用HTPD纯化轮状病毒抗原，而Biogen采用HTPD纯化腺相关病毒(AAV)载体。
病毒抗原层析纯化的高通量工艺开发
摘要：层析是生物技术工业广泛使用的一种方法，其作用是将所需产物从工艺和产品相关杂质中分离出来。目前市面上有很多基于不同形式(如电荷、疏水性和亲和性)的填料可供选择，以提供一系列的方法来应对不同产物的分离挑战。本文介绍了一种解决病毒抗原纯化工艺开发挑战的方法。此类产物的一个独特特点是，保护性预防不仅针对一个抗原的一个株，即疫苗通常是多价的。这就需要针对每种抗原进行多个生产工艺，所有这些工艺都需要单独的开发和验证。理想情况下，应该寻求一种通用的纯化方法，但是不同的蛋白质亚单位(通常用作抗原)使得这种方法极具挑战性，一般需要定制化的纯化步骤。这也意味着这些产物层析阶段的工艺开发可能特别具有挑战性且需耗费大量的人工。当有许多可用的选择时，做出针对每个产品、工艺和株的关键工艺决策，通常是昂贵且耗时的。为了解决这个问题，以＜1 mL柱体积以及自动化方法进行的规模缩小纯化被越来越多地应用来提高通量。在本项工作中，我们描述了一种独特的方法，其中部署了Tecan Freedom EVO®自动液体处理器，用于评估不同填料的化学特性和缓冲液条件，以找到合适的纯化策略。这种方法可以对分离病毒抗原的方法进行快速评估，因为在工艺开发的早期阶段，层析行为的信息通常是有限的。在这里，我们首先通过解释自动纯化脚本，然后应用该脚本对不同血清型轮状病毒抗原进行有效的纯化开发，从而证实了该方法的应用。
原文：S.Jacob, S.Konstantinidis, D.G.Bracewell, High-Throughput Process Development for the Chromatographic Purification of Viral Antigens. Vaccine Delivery Technologies, 2020, 119-182.
利用高通量策略，加速AAV纯化工艺开发
腺相关病毒载体(AAV)作为基因治疗应用的递送载体已被广泛使用。在向临床提供高纯度和效力的AAV产品时，开发一种稳健的纯化工艺是必不可少的。较短的临床时间线和支持工艺开发的物料的限制，在开发稳健且可放大的下游纯化工艺时，构成了独特的挑战。
我们克服这一挑战的方法是利用高通量(HTP)技术进行纯化工艺的开发。在这项研究中，我们证明了使用结合微型层析柱的TECAN自动液体处理系统进行纯化工艺开发的能力。研究比较了以高通量形式和传统实验室规模层析进行纯化时的工艺性能和产物质量。建立的高通量策略证明具有良好的可行性，显著减少了物料需求，并缩短了开发时间线。随着进一步的扩展和优化，我们设想这个HTP平台可以用于基因治疗产品下游纯化工艺的优化和表征。
原文：X.Fu, Leveraging High-Throughput Strategies to Accelerate AAV Purification Process Development. BioProcess International, 2020.
为什么微型纯化是生物工艺的未来?
HTPD是一个集成了微型化、自动化和并行化理念的迭代工艺开发链，而微型纯化是HTPD中必不可少的环节。HTPD包括：
微型生物反应器，如Sartorius Ambr®250系统或Applikon® micro-Matrix
如上所述的微型纯化
自动化检测，如ELISA和Bradford检测，以及诸如电泳、高效液相色谱（HPLC）、液相色谱质谱(LCMS)的分析方法。
针对细胞培养工艺监测的自动化高通量工作流（J.Dong，et al., 2016）。
随着微型化、平行生物反应器和自动化液体处理装置的日益采用，复杂的DoE工作得以实现，微型化纯化将成为所有生物工艺实验室的标准方案，以期以更短的开发周期和更低的材料成本，实现更稳健的生物工艺。HTPD最大的好处是可以同时研究生产和纯化参数，克服了生物工艺中的传统挑战。事实上，为提高上游细胞培养步骤的效率而选择的许多参数，可以对下游单元操作产生重要的影响。
其它参考文献：
J.Dong, N.Migliore, S.J.Mehrman, et al., High-Throughput, Automated Protein A Purification Platform with Multiattribute LC–MS Analysis for Advanced Cell Culture Process Monitoring. Analytical Chemistry, 2016, 88, 17,8673-8679.
L.Fernandez-Cerezo, M.K.Wismer, J.Han, et al., High throughput screening of ultrafiltration and diafiltration processing of monoclonal antibodies via the ambr® crossflow system. Biotechnology Progress, 2020, https://doi.org/10.1002/btpr.2929.
Dynamic Binding Capacity with Antha and Tecan Te-Chrom™. https://www.synthace.com/. 2020
填料/工艺筛选和样品制备 - OPUS® RoboColumn®预装层析柱
OPUS® RoboColumn® 预装层析柱自 2007 年起已被行业所采用，其设计与液体处理工作站配合使用，以实现全自动化的平行层析。
最多96根RoboColumn®预装层析柱（平行排列8种层析柱类型）可根据应用要求，独立排列在96孔阵列板上。层析柱内所含的填料在两个过滤器筛板之间形成柱床，根据填料压缩要求进行验证，以确保高效、良好不对称性以及稳健的层析性能。
可预装用户指定的层析填料 - 已超300种填料类型
以正确的轴向压缩一致地装填
以液体处理工作站的移液速度控制的线性流速操作
由于恒定的保留时间，具有经证实的规模放大和规模缩小性能
单位时间更多的样品数量，多重平行开发的能力
筛选和样品制备应用
填料筛选 / 条件筛选
用于特定分子的纯化工艺的开发需要针对每一个层析步骤进行填料以及操作条件的评估。当在pH 3.7-7.0 的 8 种不同条件下比较12 种CIEX 填料时，在Tecan Freedom EVO® 上使用OPUS® RoboColumn® 可在 1.5 天内获得多达 96 个伪-色谱图 (1536 个数据点)。
样品制备 / 过程分析技术 (PAT)
发酵过程中监测
蛋白质表征
药物发现
生物治疗药物的开发和生产需要对工艺中的中间体进行大量的分析表征工作。未纯化的样品在进行分析之前需要进行样品制备。OPUS® RoboColumn® 可一步实现多个样品的平行纯化。
在Tecan Freedom EVO® 上使用 OPUS® RoboColumn® ，每次 RoboColumn® 运行可获得 2mg - 24mg API (活性药物底物)。
规格
板尺寸 | 128.3 L x 86.0 W x 14.0 mm H | |||||
板材料 | 聚氧亚甲基共聚物 | |||||
孔数 | 96 | |||||
柱体积 | 50 µL | 100 µL | 200 µL | 450 µL | 500 µL | 600 µL |
柱床高度 | 2.5 mm | 5.0 mm | 10.0 mm | 22.5 mm | 25.0 mm | 30.0 mm |
层析柱内径 直径 | 5 mm | |||||
柱材料 | 聚丙烯 | |||||
化学稳定性 | 所有常用水性缓冲液，pH 1 – 14，有机溶剂*。 | |||||
柱储存溶液 | AIEC 和 CIEC 层析柱：20 %乙醇 + 150 mM 氯化钠 | |||||
推荐 储存温度 | AIEC、CIEC、HIC、SEC 和 MMC：+4°C - +30°C | |||||
工作温度 | +4°C - +30°C | |||||
最高工作 压力 | 最高 8.0 bar | |||||
流速 | 16 – 1000 cm/h** | |||||
标签 | 激光印刻在每根层析柱柱体上。标签包含： |
* 注意：还需要考虑所预装的层析填料的化学稳定性。更多信息，请参考厂商的填料规格说明。
** Te‑Chrom™ 向导程序的液体转移菜单可用于每个移液和层析步骤流速的设定(5.1.1.6 液体转移，Te‑Chrom™ 向导程序软件手册，396076，en，V1.0)。
RoboColumn®运行过程动画演示
自动化高通量病毒载体纯化
OPUS PD预装层析柱的高效应用
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